Eksperiment Beginsel
Hemoglobienelektroforese het ten doel om verskeie normale en abnormale hemoglobiene op te spoor en te bevestig.
As gevolg van die verskillende ladings en iso-elektriese punte van verskillende hemoglobientipes, in 'n sekere pH-bufferoplossing, wanneer die isoelektriese punt van hemoglobien laer is as die pH van die bufferoplossing, dra hemoglobien 'n negatiewe lading en migreer na die anode tydens elektroforese. Omgekeerd beweeg hemoglobien met 'n positiewe lading na die katode.
Onder 'n sekere spanning en na 'n spesifieke elektroforese tyd, vertoon hemoglobiene met verskillende ladings en molekulêre gewigte verskillende migrasie rigtings en spoed. Dit maak voorsiening vir die skeiding van afsonderlike sones, en daaropvolgende kolorimetriese of elektroforetiese skanderingsanalise kan op hierdie sones uitgevoer word om verskeie hemoglobiene te kwantifiseer. Die mees algemeen gebruikte metode is pH 8.6 sellulose asetaat membraan elektroforese.
Binne die sitoplasma word etileenglikolgroepe (CHOH-CHOH) wat in glikogeen of polisakkariedstowwe voorkom (soos mukopolisakkariede, mukoproteïene, glikoproteïene, glikolipiede, ens.) deur periodiese suur geoksideer en in aldehiedgroepe (CHO-CHO) omgeskakel. Hierdie aldehiedgroepe kombineer met die kleurlose persrooi Schiff-reagens en vorm 'n persrooi kleurstof wat neerslaan waar polisakkariede in die sel teenwoordig is. Hierdie reaksie staan bekend as periodieke suur-Schiff (PAS) kleuring, voorheen na verwys as glikogeen kleuring.
Eksperiment metode
Materiaal:Sellulose-asetaatmembrane, elektroforese-apparaat(DYCP-38C en kragtoevoer DYY-6C), Uitstekende monster laai instrument (pipet), spektrofotometer, kolorimetriese kuvette, buffers.
Buffer:
(1) pH 8.6 TEB Buffer: Weeg 10.29 g Tris, 0.6 g EDTA, 3.2 g boorsuur, en voeg gedistilleerde water by 1000 ml.
(2) Boraatbuffer: Weeg 6,87 g boraks en 5,56 g boorsuur, en voeg gedistilleerde water by 1000 ml.
Prosedure:
Pherstel van hemoglobienoplossing
Neem 3 ml bloed wat heparien of natriumsitraat bevat as 'n antikoagulant. Sentrifugeer teen 2000 rpm vir 10 minute en gooi die plasma weg. Was die rooibloedselle drie keer met fisiologiese sout (750 rpm, 5 minute sentrifugering elke keer). Sentrifugeer teen 2200 rpm vir 10 minute en gooi die supernatant weg. Voeg 'n gelyke hoeveelheid gedistilleerde water by, voeg dan 0,5 keer die volume koolstoftetrachloried by. Skud kragtig vir 5 minute, en sentrifugeer dan teen 2200 rpm vir 10 minute om die boonste Hb-oplossing te versamel vir latere gebruik.
Week die Membraan
Sny die sellulose-asetaatmembraan in repe van 3 cm × 8 cm. Week hulle in pH 8.6 TEB-buffer tot heeltemal versadig, verwyder dan en vee droog met filtreerpapier.
Spotting
Gebruik 'n pipet om 10 μl van die hemoglobienoplossing vertikaal op die sellulose-asetaatmembraan (die growwe kant), ongeveer 1,5 cm van die rand af te sien.
Elektroforese
Gooi die boraatbufferoplossing in die elektroforesekamer. Plaas die sellulose-asetaatmembraan met die gevlekte kant by die katode-kant van die kamer. Hardloop teen 200 V vir 30 minute.
Eluering
Sny die HbA- en HbA2-sones uit, plaas dit in aparte proefbuise en voeg onderskeidelik 15 ml en 3 ml gedistilleerde water by. Skud liggies om die hemoglobien heeltemal te elueer, en meng dan.
Kolorimetrie
Nul die absorpsie deur gebruik te maak van gedistilleerde water vir die elueringsoplossing en meet die absorpsie by 415 nm.
Berekening
HbA2(%) = Absorbansie van HbA2-buis / (Absorbansie van HbA-buis × 5 + Absorbansie van HbA2-buis) × 100%
Eksperimentele resultate Berekening
Verwysingsreeks vir pH 8.6 TEB-buffer Sellulose-asetaatelektroforese: HbA > 95%, HbA2 1%-3.1%
Notas
Elektroforesetyd moet nie te lank wees nie. Die sellulose-asetaatmembraan moet nie tydens elektroforese uitdroog nie. Stop elektroforese wanneer HbA en HbA2 duidelik geskei is. Langdurige elektroforese kan banddiffusie en vervaging veroorsaak.
Vermy die gebruik van te veel monster. Oormatige hemoglobienvloeistof kan lei tot bandlosmaak of onvoldoende kleuring, wat lei tot vals verhoogde HbA-vlakke.
Voorkom kontaminasie van die sellulose-asetaatmembraan met proteïene.
Die stroom moet nie te hoog wees nie; anders mag hemoglobienbande nie skei nie.
Sluit altyd monsters van normale individue en nodige bekende abnormale hemoglobiene in as kontrole.
Beijing Liuyi Biotechnology vervaardig die professionele elektroforesetenk vir hemoglobienelektroforese wat die model isDYCP-38Csellulose asetaat membraan elektroforese tenk, en daar is twee modelle van elektroforese kragtoevoer beskikbaar vir die sellulose asetaat membraan elektroforese tenkDJJ-2CenDJJ-6Ckragtoevoer.
Intussen verskaf Beijing Liuyi Biotechnology sellulose-asetaatmembraan vir kliënte, en die grootte van sellulose-asetaatmembraan kan aangepas word. Welkom om ons te vra vir monsters en meer inligting.
Beijing Liuyi-handelsmerk het meer as 50 jaar geskiedenis in China en die maatskappy kan stabiele produkte van hoë gehalte regoor die wêreld verskaf. Deur jare se ontwikkeling is dit jou keuse werd!
Ons is nou op soek na vennote, beide OEM elektroforese tenk en verspreiders word verwelkom.
As jy enige aankoopplan vir ons produkte het, moet asseblief nie huiwer om ons te kontak nie. Jy kan vir ons boodskap stuur by e-pos[e-pos beskerm]of[e-pos beskerm], of skakel ons asseblief by +86 15810650221 of voeg Whatsapp +86 15810650221 by, of Wechat: 15810650221
Postyd: 20 September 2023